GFP抗體應用中的常見問題有哪些？

標簽：抗體  蛋白質結構 科學  科普 GFP抗體

   GFP適合于蛋白質標記，這是該抗體的天然優(yōu)勢。雖然它非常適合實時成像，例如，作為 TP53 MITE-seq 屏幕的報告器，其他應用導致 GFP 熒光猝滅，這使得有必要使用抗 GFP 抗體。組織樣本的冷凍保存、組織學制備和固定劑的使用通常會導致 GFP 熒光*或部分喪失，因此需要使用抗 GFP 抗體來獲得可靠的結果。

  通過蛋白質印跡檢測 GFP 標記的蛋白質和通過免疫沉淀研究蛋白質 -蛋白質相互作用也需要使用 GFP 抗體。抗GFP抗體可用作多克隆或單克隆抗體，適用于在蛋白質印跡、免疫沉淀、免疫組織化學、免疫細胞化學定位和免疫吸附測定 (ELISA) 上檢測 GFP、GFP 變體和 GFP 融合蛋白。

GFP的分子結構與特征

GFP 形成一個比較穩(wěn)定的桶形結構，由圍繞中央 α 螺旋的 11 個 β折疊組成。β 表通過富含脯氨酸的環(huán)連接。每個片層中的氨基酸側鏈交替突出到蛋白質內部或從表面向外突出。GFP 發(fā)色團由 Ser65、Tyr66 和 Gly67 的分子內環(huán)化形成，它幾乎位于環(huán) 的中心。盡管這三個氨基酸基序在自然界中很常見，但它不會產(chǎn)生熒光。

    正是 GFP β-*的內部環(huán)境產(chǎn)生了發(fā)色團并保護它免于猝滅。發(fā)色團的形成是自催化的。GFP 以 Max激發(fā)波長為 395 nm 的主要質子化狀態(tài)和具有 475 nm 激發(fā)峰的不那么普遍的非質子化狀態(tài)存在。兩種形式的熒光發(fā)射均在 510 nm 處達到峰值。

抗 GFP 抗體是否也識別 GFP 的變體？

抗 GFP 抗體可識別 Aequorea victoria GFP 的其他變體。

為什么在蛋白質印跡上沒有抗 GFP 抗體的信號？

蛋白質印跡后缺乏信號可能表明存在一些不同的問題。沒有或非常差的傳輸意味著沒有信號。可以通過 Ponceau-S 染色檢查缺乏良好的膜轉移。氣泡的存在也會導致轉印不良。GFP 標記蛋白的表達水平可能太低。加載更大體積的樣品并包括陽性對照。非常稀釋的抗體可能是問題所在，嘗試使用幾種不同濃度的抗體來探測蛋白質印跡。此外，一種遙遠的可能性是 GFP 標簽超出幀并且未表達，導致缺少任何信號。

GFP信號太弱無法成像，可以增強信號嗎？

在某些實驗條件下，GFP 熒光會部分或*丟失。因此，一些表達 GFP 標記蛋白的細胞結構可能難以可視化或成像。 GFP-Booster 是一種源自駱駝科動物的 VHH 結構域結合蛋白，與強熒光染料偶聯(lián)。這穩(wěn)定并增強了熒光信號。

為什么用抗 GFP抗體進行免疫沉淀后會觀察到多個條帶？

抗體交叉反應是一個常見問題，通常會導致比預期更多的條帶。更嚴格的實驗條件可能會解決這個問題。GFP-Trap 可用于免疫沉淀實驗。GFP-Trap 是一種單域抗體（源自駱駝科動物），具有更高的特異性、穩(wěn)定性和親和力。然而，必須考慮到，如果產(chǎn)生了截短的融合蛋白，如果存在標簽，這些也將被抗體檢測到，并導致多個條帶。

 蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司長期供應生物實驗室儀器設備及生物試劑，其中抗體包括abcam/Thermo Fisher等抗體