實時熒光定量PCR法進行無乳鏈球菌血清分型的實驗步驟

B組鏈球菌(GBS) 是一種熒光檢測帶有包膜的革蘭氏陽性菌，是新生兒侵襲性感染敗血癥和腦膜炎的重要原因，GBS血清抗體傳統(tǒng)分型法通常需要經(jīng)過乳膠凝集、多重 PCR 和條帶大小分析或全基因組序列分析等步驟，過程繁瑣，技術(shù)成本昂貴，所以在PCR實驗室中采用實時熒光定量PCR 法進行血清分型不僅可以替代乳膠凝集法，還可以改進 GBS 血清型數(shù)據(jù)的采集。



GBS 細菌菌株分離與培養(yǎng)
將GBS 分離株在胰蛋白酶大豆 (TS) 或 5% 羊血瓊脂平板上于37°C 培養(yǎng)，然后在 TS 培養(yǎng)基中于 37°C 培養(yǎng)過夜。

通過乳膠凝集進行血清分型
根據(jù)制造商的說明，使用 Immulex Latex Agglutination Streptococcus B 試劑盒（Staten Serum Institute；Copenhagen，Denmark）通過乳膠凝集對所有 GBS 分離株進行血清分型。簡而言之，將 10 μl 乳膠試劑添加到懸浮在 10 μl 鹽水中的單個 GBS 菌落中。如果 30 秒后可見凝集，則旋轉(zhuǎn)反應(yīng)并解釋為陽性。 

實時熒光定量法 PCR 進行血清分型
設(shè)計引物和探針以擴增無乳鏈球菌每種血清型的多糖莢膜基因的區(qū)別區(qū)域。引物中的寡核苷酸未經(jīng)修飾和脫鹽，探針用熒光探針（5' 6-羧基熒光素 (6-FAM)）和兩種猝滅劑標記，并通過高壓液相色譜法純化.

PCR實時熒光定量分析
使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 從 GBS 的過夜培養(yǎng)物中提取基因組 DNA。PCR 反應(yīng)最終體積為 20 μl，由 10 μl Taqman Universal Mastermix、7.4 μl 無菌水、0.2 μl 正向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 反向引物（100 μM 原液）、0.2 μl 探針（100 μM 儲備液）和 2 μl GBS DNA（25 ng/μl）。在 熒光定量PCR儀器上進行三次反應(yīng)，并進行軟件分析。反應(yīng)參數(shù)如下： 50°C 初始孵育 2 分鐘；在 95 °C 下初始變性 10 分鐘；在 95 °C 15 秒和 60 °C 1 分鐘下進行 35 個 PCR 循環(huán)。陽性反應(yīng)定義為循環(huán)閾值（CT ) < 30 對于 50 ng DNA 模板/反應(yīng)。每次運行都包含陰性對照反應(yīng)（無 DNA 模板）。實驗結(jié)果與乳膠凝集進行比較。通過對比實驗發(fā)現(xiàn)使用實時熒光定量 PCR 方案檢測到預(yù)測序列，并且與任何其他血清型引物/探針組合沒有陽性反應(yīng)。而后通過乳膠凝法集確認了 47 株菌株的血清型，由此驗證基于 PCR 的方法和乳膠凝集方法的血清分型結(jié)果無差異。
 實驗方法對比
我們知道用于 GBS 血清分型技術(shù)的基于非核酸的實驗室方法成本較高，并且需要高滴度的血清型特異性抗血清，并且會阻礙 GBS 血清型流行率的研究。而乳膠凝集試劑盒可若用于實驗室的 GBS 血清分型，其價格也較貴。通過分子莢膜分型技術(shù)，包括多重 PCR   全基因組序列的靶向分析新可用的序列信息的適應(yīng)性和相對容易的性能，但僅能分血清型 Ia、Ib 和 III 三種血清型。

   與許多現(xiàn)有方法不同，實時 PCR 法的血清分型不是基于操作員對生化反應(yīng)的解釋，它允許特異性鑒定 GBS 血清型，盡管會受到其他細菌 DNA 的干擾，但它可能在流行病學研究的背景下比較有用，作為現(xiàn)有多重 PCR 檢測的替代方法。隨著進一步的發(fā)展，這種新方法可以直接從標本中檢測 GBS 血清型，而無需培養(yǎng)。這種方法基于實時 PCR 的血清分型雖然便捷，但檢測由于需要特定的引物-探針組所以暫時無法直接識別新的血清型。

來源：蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司