轉(zhuǎn)染是一種將外來顆粒和核酸轉(zhuǎn)移到細胞中的技術(shù),它可以通過化學(xué)的方式來實現(xiàn)。轉(zhuǎn)染試劑用于提高基因?qū)嶒灥男剩瑥亩梢栽趹?yīng)用基因和基因組令人難以置信的功能領(lǐng)域進行大量研究。在所有轉(zhuǎn)染實驗中,轉(zhuǎn)染方式的選擇尤為重要。下面描述了一些較突出的基于化學(xué)的轉(zhuǎn)染試劑。
一、基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑
脂質(zhì)體是包裹帶負(fù)電荷的核酸序列的陽離子脂質(zhì)。它們被細胞膜吸引并通過內(nèi)吞作用整合到宿主細胞中。內(nèi)體酶分解脂質(zhì)體,DNA片段被釋放到細胞質(zhì)中。這些囊泡是由磷脂人工制造的,主要來自含有帶負(fù)電荷和中性脂質(zhì)的混合物,這些脂質(zhì)能夠自動與核酸相互作用,形成進入細胞的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。該方法對細胞的毒性較小,可以確保大DNA片段整合到宿主細胞中,轉(zhuǎn)染效率高。常見的轉(zhuǎn)染試劑有LIP2000和LIP3000等。
已用靶向配體和分子綴合物修飾的聚乙二醇-膽固醇 (PEG-Ch) 綴合物可以提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率。Ch2-PEGn可以通過酯化獲得,使用溶解的膽固醇和PEG,真空濃縮并在硅膠上純化。陽離子脂質(zhì)體可以通過將CHCl32、Ch2-PEGn 和 DOTAP 的混合物溶解在氯仿中并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器下去除溶劑來獲得,這增強了脂質(zhì)薄膜的形成,可以在真空下進一步干燥,加上添加 5% 葡萄糖溶液和超聲處理即可。
二、基于聚合物的轉(zhuǎn)染試劑
陽離子聚合物與帶負(fù)電荷的核酸序列結(jié)合,帶正電荷的復(fù)合物被細胞膜吸引并通過內(nèi)吞作用整合到宿主細胞中。此類試劑包括 PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物),一種可安全用于轉(zhuǎn)染程序的食品級聚合物,以及 PBAE(聚-β-氨基酯),一種能夠保護 DNA 分子的聚合物在宿主細胞內(nèi)遞送。這些從 PLGA(聚乳酸-乙醇酸共聚物)和 PBAE(聚-β-氨基酯)獲得的聚合物可用于將 DNA 構(gòu)建體安全有效地輸送到培養(yǎng)細胞中。 許多基于聚乙烯亞胺的聚合物,并用于多種哺乳動物細胞系以及昆蟲和細菌細胞中進行瞬時和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染。基于聚乙烯亞胺的聚合物可用于培養(yǎng)神經(jīng)元細胞。成熟的神經(jīng)元由于不經(jīng)歷細胞分裂,所以神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物較難培養(yǎng)。 雖然細胞分裂的缺乏可以通過腫瘤性、永生化的神經(jīng)細胞來克服,但由于癌性神經(jīng)元和普通神經(jīng)元細胞之間存在著重大差異。所以只能通過基于聚乙烯亞胺的聚合物涂層來抑制神經(jīng)元細胞退化。
三、基于納米顆粒的轉(zhuǎn)染試劑
納米顆粒是由無機和有機顆粒和聚合物組成的非病毒載體,可用于基因傳遞,避免使用天然生物聚合物(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖)時的毒性和相容性問題。這些載體確保基因遞送到特定細胞或特定組織中,用于基因治療。
聚乙烯亞胺和三聚磷酸鹽組成的納米顆粒多數(shù)是通過冷凍干燥法。科學(xué)家們使用納米粒子將 siRNA 和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到癌細胞系和原代細胞培養(yǎng)物中。大多數(shù)DNA 轉(zhuǎn)染 試劑與對血清敏感的siRNA不相容,因此納米顆粒在RNAi轉(zhuǎn)染中起著至關(guān)重要的作用。
四、細胞系特異性轉(zhuǎn)染試劑
磷酸鈣轉(zhuǎn)染是較早開發(fā)的用于將外源核酸轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的哺乳動物細胞的一種化學(xué)轉(zhuǎn)染法。目前結(jié)合包裹核酸的納米顆粒、脂質(zhì)體、脂質(zhì)和聚合物基載體分子的開發(fā)了新一代轉(zhuǎn)染試劑即:經(jīng)過優(yōu)化的細胞系特異性轉(zhuǎn)染試劑,它可提供高轉(zhuǎn)染效率和較小的細胞毒性。這類預(yù)優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑和相關(guān)的轉(zhuǎn)染方案,適用 于體外 和 體內(nèi) 轉(zhuǎn)染應(yīng)用。
細胞系對轉(zhuǎn)染方案的反應(yīng)是不相同;比如:某些不經(jīng)常復(fù)制的細胞不太可能表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)染效率。因此,不同細胞類型的各種轉(zhuǎn)染實驗必然會有不同的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染的研究應(yīng)用通常涉及轉(zhuǎn)染的核酸序列的影響,實驗室使用預(yù)先優(yōu)化的試劑可以提升轉(zhuǎn)染效率,而且不會因重復(fù)轉(zhuǎn)染試驗而導(dǎo)致時間損失。
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